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瘤源性血管性血友病因子对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制

日期:2022年03月24日 编辑:ad201107111759308692 作者:无忧论文网 点击次数:110
论文价格:150元/篇 论文编号:lw202203171527196844 论文字数:35255 所属栏目:医学论文范文
论文地区:中国 论文语种:中文 论文用途:硕士毕业论文 Master Thesis
本文是一篇医学论文,本实验以 BGC823 胃癌细胞为研究对象,初步研究了瘤源性 vWF 对BGC823 胃癌细胞生物学行为的影响及其可能的分子机制,更全面地认识了不同来源的 vWF 对胃癌细胞的影响,为后续的研究提供了一定的理论基础。机体是一个复杂环境,进一步研究需完善体内实验,在动物模型中验证瘤源性 vWF 对肿瘤发生发展的调控作用及机制,为肿瘤的靶向治疗提供新的研究思路。
一 前言
1.1 胃癌的流行病学以及治疗现状
1.1.1 胃癌的流行病学现状
癌症在中国是最主要的死亡原因之一,给中国经济带来很大负担[1],据估计2018 年中国新增的癌症病例及癌症死亡病例分别为 430 万例、290 万例,其中消化道癌症如胃癌、肝癌及食管癌等引起的癌症死亡占比 36.4%,然而在美国及英国,消化道癌症死亡病例只占癌症死亡病例总数的 5%,中国癌症的发病率低但死亡率较发达国家高,这一现象可能与癌症早期诊断率低以及不同地区癌症治疗策略不统一有关[2]。根据 WHO 2020 年最新统计结果显示[3],胃癌是全球范围内第五大常见癌症、第四大癌症死亡原因(图 1-1 A.B.),全球范围的男性病例中,胃癌的新发病例及死亡病例均位居第四(图 1-1 C.),亚洲地区作为胃癌的高发区,2020 年新发病例占全球新发病例的 75.3%,死亡病例占比 74.8%,而中国胃癌新发病例数以及死亡病例数都位居亚洲之首(图 1-1 D.)。2020 年中国的胃癌新发病例及死亡病例在中国癌症总数中的占比分别为 10%及 12%,均位居第三(图 1-1 E.)。甘肃省的胃癌发病率及死亡率均高于全国平均水平[4]。肿瘤的发生发展是一个多因素影响的过程,导致胃癌发病的因素较多,其中最重要的是幽门螺杆菌感染,其次还包括高龄、高盐饮食、社会经济地位低、吸烟、饮酒、家族史、胃部手术史、恶性贫血、生活环境及新鲜水果及蔬菜摄入较少的饮食方式等[5]。医学论文范文参考
1.2 血管性血友病因子与肿瘤的关系
血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是存在于血浆中的一种大分子糖蛋白,vWF 前体(pro-vWF)由 2813 个氨基酸组成,其中信号肽 22 个,前肽 741 个,成熟亚基 2050 个[19]。pro-vWF 在分泌前会经过广泛的翻译后修饰,pro-vWF 蛋白的信号肽被切割后进入内质网,在内质网中形成 vWF 二聚体,随后该二聚体被转运至高尔基体中进行进一步修饰并形成高度糖基化的多聚体[20]vWF 大部分由内皮细胞合成,部分由巨核细胞合成[21]。内皮细胞产生的 vWF 通常储存在 W-P 小体(Weibel-Palade body,WPB)中,而巨核细胞产生的 vWF储存在α-颗粒中[22]。受到各种病理性刺激或炎症因子的刺激时 vWF 大量释放,循环中的 vWF 以超大型形式(ULvWF)存在,ULvWF 由几百个 vWF 单体组成,在循环中会被应力、碰撞以及与血管壁的分子相互作用破坏。有实验发现在小鼠模型中,循环中的 vWF 主要由肝脏吸收,部分由脾脏和肾脏吸收[23]。
1.2.1 vWF 的生物学作用
vWF 具有两种重要的生物学功能:介导血小板的粘附和聚集、凝血因子 VIII的载体蛋白[24]。有研究发现 vWF 不仅在血栓形成过程及止血过程中有重要调节作用,而且还参与调节血管生成、平滑肌细胞的增殖、免疫系统的正常运作等,并已成为多种疾病的生物学标志物[25,26]。vWF 作为一种重要的内皮损伤标志物,可作为许多疾病的诊断或预后指标[22]。近年来研究发现 vWF 与肿瘤发生发展密切相关,vWF 作为肿瘤发生发展过程中重要的调节因子,有望成为肿瘤诊断、治疗的新靶点。
1.2.2 肿瘤患者 vWF 水平升高
大量研究发现,血浆 vWF 水平在多种肿瘤患者中升高,如胃癌、乳腺癌、膀胱癌等。本实验团队前期一项针对 110 例胃癌患者的血浆检测发现,正常对照组、上皮内瘤变患者和胃腺癌患者血浆 vWF 抗原水平分别为 12.92μg/mL、15.29μg/mL 和 18.84μg/mL,且肿瘤分化程度与患者血浆 vWF 水平呈负相关,其中低分化胃腺癌患者血浆 vWF 水平最高[27]。研究发现高水平的血浆 vWF 不仅与癌症相关血栓性疾病的发生有关,而且与肿瘤恶性程度、转移[28]和预后[29.30]相关。
二 材料与方法
2.1 细胞系及其来源
人胃腺癌细胞株BGC823细胞购买于中国典型培养物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection,CCTCC)。BGC823-vWF 细胞和 BGC823-Sham 细胞为本课题组前期对 BGC823 细胞分别使用重组质粒 pEGFP-N1-vWF 以及空质粒 pEGFP-N1 进行稳定转染并通过单克隆及有限稀释法筛选后得到的细胞,BGC823-vWF 细胞能够稳定过表达 vWF。医学论文范文怎么写

2.2 主要试剂、耗材
1640 培养基(美国 HyC lone 公司)胎牛血清(以色列 Biological Industries 公司)胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)青链霉素(北京索莱宝科技有限公司)二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)(北京索莱宝科技有限公司)PBS 缓冲液 0.01M,PH 7.2-7.4(北京索莱宝科技有限公司)噻唑蓝 MTT(北京索莱宝科技有限公司)一次性 0.22μm 孔径过滤器(美国 DIKMA 公司)4%多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)2.5%结晶紫染液(北京索莱宝科技有限公司)RIPA 裂解缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)蛋白酶抑制剂 PMSF(普利莱基因技术有限公司)蛋白磷酸化酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司)BCA 蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)5×蛋白上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)30%Acr-Bris 29:1(合肥 Biosharp 生物科技有限公司)SDS(北京索莱宝科技有限公司)10%APS(北京索莱宝科技有限公司)TEMED(中国 BIO BASIC 公司)Tween20(德国 Biofroxx 公司)预染蛋白分子量 Marker(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)PVDF 膜(美国 Millipore 公司)vWF 兔多克隆抗体(沈阳万类生物科技公司)MMP2 兔多克隆抗体(沈阳万类生物科技公司)MMP9 兔多克隆抗体(沈阳万类生物科技公司)AKT 兔多克隆抗体(沈阳万类生物科技公司)p-AKT(Ser473) 兔多克隆抗体(沈阳万类生物科技公司)mTOR 兔多克隆抗体(美国 GeneTex 公司)p-mTOR 兔多克隆抗体(美国 GeneTex 公司)GAPDH 兔多克隆抗体(美国 Immunoway 公司)免疫印迹荧光标记二抗 (美国 Li-cor 公司)BSA(北京索莱宝科技有限公司)Matrigel 基质胶(美国 BD 公司)6 孔板(美国 Corning 公司)24 孔板(美国 Corning 公司)96 孔板(美国 Corning 公司)Transwell 小室(美国 Costar 公司)细胞计数板(上海睿钰生物科技有限公司)MK2206 2HCL(美国 selleck 公司)
三 结果...............................19
3.1 生信分析 vWF 在胃癌中的表达及与胃癌患者预后的关系.....................19
3.2 重组质粒转染的 BGC823 胃癌细胞的鉴定..........................20
3.3 瘤源性 vWF 对 BGC823 细胞增殖的影响..............................22
3.4 瘤源性 vWF 对 BGC823 细胞迁移的影响...................................22
四 讨论....................................33
五 结论............................................37

四 讨论
1.BGC823 胃癌细胞中 vW F 表达情况
vWF 是血浆中重要的大分子糖蛋白,在多项研究中发现,血浆 vWF 水平在多种肿瘤患者中升高,如胃癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌等,一些研究发现vWF 水平与肿瘤分期及临床预后相关。研究表明结直肠癌患者血浆 vWF 水平与肿瘤分期相关,并可作为判断预后的独立指标[101],晚期非小细胞肺癌患者血浆vWF 水平与肿瘤的分级分期相关[102],肝癌患者血浆 vWF 水平与肿瘤临床病理分期相关[103]。胃腺癌患者血浆 vWF 水平明显增高,且 vWF 水平与肿瘤分化程度相关[27]。
为探讨胃癌 vWF 的表达情况,本实验通过生物信息学方法分析了 GSE19826数据集、GSE27342 数据集以及 GSE13911 数据集中 vWF mRNA 在胃癌组织以及正常组织中的表达情况,结果显示胃癌组织中的 vWF mRNA 表达水平显著增高,且 TCGA 数据库分析结果显示不同级别淋巴结转移患者胃癌组织的 vWF mRNA表达水平较正常组织均明显升高。进一步我们使用 Kaplan meier 对胃癌患者进行了生存分析,结果显示高表达 vWF 的胃癌患者的总体生存期、无进展生存期以及进展后生存期均降低,生物信息学结果提示 vWF 与胃癌的进展及预后具有密切关系。本实验室团队前期使用免疫荧光、WB、RT-PCR 等多种实验方式检测到 BGC823 胃癌细胞中 vW